提取组织器官RNA|净信多样品组织匀浆机实验案例

组织样品中RNA的提取实验：本实验的组织样品主要有小鼠的各个组织器官（如肝脏，肌肉，脂肪等）和人肿瘤标本（如结直肠癌，肺癌，乳腺癌）

1.首先要根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的TRIZOL液体，同时加入若干颗不锈钢柱。本实验室一般情况如下：（小鼠组织加入TRIZOL,结直肠癌标本加入TRIZOL）

注意：

a.用净信匀浆机进行匀浆处理时样品体积不要超过TRIzol体积10℅）

b.需事先预冷试管座

2.把加入样品,TRIZOL,不锈钢柱的Axygene EP管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子，点击运行

3.机器运行完毕后，打开盖子，拿出净信EP管仔细观察组织的研磨情况，如果没有明显的块状物，那就可以进入下一步实验步骤，如果没有完全打碎，还需要把EP管放入试管座中，继续匀浆。有些坚硬，或者脂肪含量高的组织（乳腺）可能需要稍微长一点的时间，时间可以依据组织实际的研磨情况来调整匀浆时间。

4.和传统的TRIZOL提取RNA的方法一样,将匀浆样品在室温放置几分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡若干秒，室温放置几分钟。

6.2-8℃10000×g离心十几分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

7.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入异丙醇，室温放置几分钟。

8.2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心几分钟，弃上清。

10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入无RNase的水,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。

常见问题分析：

1得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B.RNA沉淀未完全溶解

C.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高

D．样品匀浆时加的试剂量太少

E．匀浆样品时未在室温放置几分钟

F．吸取水相时混入了有机相

2 RNA降解

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C.细胞在用胰酶处理时过度

D.溶液或离心管未经RNase去除处理

E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

3 DNA污染:

A.样品匀浆时加的试剂量太少

B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液

预防RNA污染注意事项：

1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3．RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

4．配制溶液应使用无RNase的水

本实验已经研磨的各个组织中发现肝脏组织是很容易研磨且研磨效率是很好的。

下图A是RNA经过传统的液氮研磨和匀浆器研磨法抽出的RNA跑胶图，结果很明显发现这种方法是可行的，是可以代替传统的方法的。

下图B是利用组织匀浆器对小鼠的各个组织进行匀浆抽出的RNA跑胶图。发现在抽提各个组织的RNA的时候也是可行的。

图C是利用组织匀浆器对人结肠癌标本进行了研磨后抽提出的RNA的跑胶图。

图D是小鼠的肝脏组织经过手工研磨和机器匀浆后，抽提得到的RNA进行了浓度的测定，结果说明组织匀浆器抽提出得RNA的浓度要显著高于传统的手工的方法得到的RNA。

蛋白质的提取

A.根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的蛋白质裂解液（如RIPA），同时加入3颗不锈钢柱。（小鼠肝脏组织加入1mlRIPA蛋白裂解液，人结直肠癌组织加入500ulRIPA蛋白裂解液）

B.把加入样品,蛋白裂解液,不锈钢柱的Axygene EP管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子，点击运行。

以下同上RNA的操作方法：

所得到的蛋白质浓度的测定经过BCA试剂盒测定完成的，同时通过SDS-PAGE后经过考马斯亮蓝染色和western blot检测都发现其要比传统的方法更加简便快捷，不容易引起交叉污染。

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